基于色木枫转录组数据的核低拷贝基因引物开发

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doi:10.12202/j.0476-0301.2022025

邓雅文^{1, 2, 3,},
陈荣樟^{1, 2, 3},
鲍蕾^{1, 2, 3},
管宇^{1, 2, 3},
王红芳^{1, 2, 3,,}

1.
生物多样性与生态工程教育部重点实验室，100875，北京
2.
东北虎豹国家公园保护生态学国家林草局重点实验室，100875，北京
3.
必威最新登录地址生命科学学院，100875，北京

基金项目:国家自然科学基金面上项目 (32071494, 32171654)

详细信息

通讯作者:
王红芳（1982—），女，博士，副教授. 研究方向：景观遗传学和谱系地理学. E-mail：wanghf@bnu.edu.cn

中图分类号:Q37
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出版历程
- 收稿日期:2022-01-11
- 录用日期:2022-05-17
- 网络出版日期:2022-12-07
- 刊出日期:2022-12-01

Low-copy nuclear gene primers based on transcriptome data ofAcer pictum

DENG Yawen^{1, 2, 3,},
CHEN Rongzhang^{1, 2, 3},
BAO Lei^{1, 2, 3},
GUAN Yu^{1, 2, 3},
WANG Hongfang^{1, 2, 3,,}

1.
Ministry of Education Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering, 100875, Beijing, China
2.
National Forestry and Grassland Administration Key Laboratory for Conservation Ecology in the Northeast Tiger and Leopard National Park, 100875, Beijing, China
3.
College of Life Sciences, Beijing Normal University, 100875, Beijing, China

摘要

摘要:基于色木枫的转录组数据初步设计166对引物，并根据琼脂糖凝胶电泳与Sanger测序结果筛选出其中的26对核低拷贝基因引物．在东亚63个种群的182个个体中大批量扩增所开发引物，单倍型多样性范围为0.45~0.97，核苷酸多样性为(1.90~18.03)×10 ⁻³；9~15对引物可在金钱槭、茶条槭、青榨槭和鸡爪槭中扩增；STRUCTURE聚类结果与之前核微卫星研究结果类似，且展示了更多的谱系地理结构，结果表明引物多态性高、拓展性强、具有可靠性．本研究的转录组数据为槭属的研究提供重要遗传信息，所用方法被证明可以有效开发大量核低拷贝基因引物，已开发出的26对引物将为色木枫的进化历史和槭属系统发育研究提供丰富有效的分子标记．
- 引物开发/
- 转录组测序/
- 核低拷贝基因/
- 槭属
Abstract:Tertiary relic temperate tree species Acer pictumis excellent to study evolutionary history in East Asia．Abundant morphological variations exist in this species, contributing to controversial classification at the species and subspecies level．Therefore low-copy primers with clear mutation mechanism and high diversity are of great significance in the evolution and taxonomy of A. pictum．In this study, we designed 166 pairs of primers based on transcriptome data, and screened for low-copy genes by agarose gel electrophoresis and Sanger sequencing．A total of 26 pairs of low-copy primers were used．Effectiveness of primers was verified by amplifications in 182 individuals of 63 populations in East Asia．Nucleotide diversity was found to range from 1.90×10 ⁻³to 18.03×10 ⁻³, haplotype diversity from 0.45 to 0.97．Nine to fifteen pairs of primers were used for successful amplifications in Dipteronia sinensis, Acer ginnala, A. davidiiand A. palmatum．STRUCTURE clustering data were found similar to previous nuclear microsatellite studies and showed more phylogenetic geography．Transcriptome data provided important genetic information for Acer, the method was effective．The 26 pairs of primers will provide rich and effective molecular markers for the study of evolutionary history of A. pictumand the phylogeny of Acer．
- primer exploitation/
- transcriptome sequencing/
- low-copy nuclear gene/
- Acer

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图 1c80508_g1序列与最近的同源物种mRNA序列比对结果

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图 2无任何多态位点的情况

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图 3多态位点只以杂合形式存在的情况

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图 4多态位点既有杂合也有纯合的情况

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图 5STRUCTURE分析中L(K)（a）与ΔK（b）随K值的变化

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图 6K＝2~11的遗传分组结果以及K=11时分组对应的地理位置

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A本研究中使用的样本种群及位置信息

物种	种群	位置	纬度	经度	样本数
Acer pictum	维西	云南	27.10	99.32	3
	香格里拉	云南	27.12	100.25	3
	泸沽湖	云南	27.74	100.75	3
	白马雪山	云南	28.29	99.17	3
	庐山	江西	29.50	115.93	3
	峨眉山	四川	29.55	103.32	3
	海螺沟	四川	29.57	101.99	3
	天平山	湖南	29.78	110.07	1
	黄山	安徽	30.14	118.16	3
	赛武当	湖北	32.43	110.75	3
	宝天曼	河南	33.49	111.95	3
	屋梁山	陕西	33.71	106.76	3
	神龙架	湖北	31.51	110.33	3
	鞍子河	四川	30.81	103.13	3
	唐家河	四川	32.53	104.62	2
	美姑	四川	28.50	102.87	3
	月河梁	陕西	33.57	108.62	3
	鹞落坪	安徽	31.01	116.11	3
	天目山	浙江	30.42	119.41	3
	小秦岭	河南	34.43	110.53	3
	大南坪	山西	36.46	111.89	3
	云梦山	河南	36.87	111.13	3
	天桂山	河北	38.26	113.71	3
	青崖寨	河北	36.98	113.80	3
	泰山	山东	36.25	117.10	3
	昆嵛山	山东	37.27	121.71	3
	东灵山	北京	40.01	115.44	3
	雾灵山	河北	40.58	117.39	3
	千山	辽宁	40.98	123.12	3
	辽河源	河北	41.31	118.50	3
	大板	辽宁	41.90	121.77	3
	大黑山	辽宁	42.01	120.48	3
	塞罕坝	河北	42.27	117.50	3
	大青沟	内蒙古	42.80	122.17	3
	克旗永隆村	内蒙古	43.57	117.75	3
	沂山	山东	36.20	118.61	3
	崂山	山东	36.21	120.60	3
	大连西郊	辽宁	38.90	121.46	3
	嶂石岩	河北	37.46	114.03	3
	大苏河	辽宁	41.93	125.00	3
	长白山	吉林	42.06	128.07	3
	汪清	吉林	43.35	130.18	3
	方正	黑龙江	45.67	128.99	3
	朗乡	黑龙江	46.69	129.06	3
	饶河	黑龙江	46.83	133.58	3
	乌伊岭	黑龙江	48.73	129.65	3
	胜山	黑龙江	49.48	126.78	3
	风月桥	黑龙江	44.79	130.82	3
	俄罗斯	俄罗斯	45.31	136.49	2
	智异山	朝鲜半岛	35.29	127.49	3
	伽里旺山	朝鲜半岛	37.43	128.56	3
	雪岳山	朝鲜半岛	38.17	128.49	3
	ohtaki	日本本州	35.84	137.54	3
	kitago	日本本州	36.72	138.15	3
	fuji	日本本州	35.30	138.72	2
	mikko	日本本州	36.75	139.42	3
	ura-hikimi	日本本州	34.55	132.05	3
	福岛	日本本州	37.69	140.07	3
	原野	日本本州	39.43	141.43	3
	村茶亭	日本北海道	43.41	144.64	3
	秋田	日本本州	40.01	140.61	3
	沾小厅	日本北海道	42.67	141.61	1
	雨龙厅	日本北海道	44.39	142.20	3
Dipteronia sinensis	桑园	陕西	33.74	107.17	2
Acer ginnala	宝天曼	河南	33.49	111.95	2
Acer davidii	桑园	陕西	33.74	107.17	2
Acer palmatum	宝天曼	河南	33.49	111.95	2

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表 126对色木枫核低拷贝基因引物的位点信息

位点	引物序列（5′–3′）	产物长度/ bp	退火温度/ °C	外显子/ bp	内含子/ bp	推测的功能
AM00033	F：CTCACCCTCCAAGCAAT	327	62	1~236	237~327	Citrus sinensis protein kinase 2B, chloroplastic
AM00033	R：GGTCCTTCCAGTCTCCC	327	62	1~236	237~327	Citrus sinensis protein kinase 2B, chloroplastic
AM00046	F：AAGAAGACCCTTATCAGTAT	631	50	1~89	90~191	Ziziphus jujuba cultivar Dongzao chromosome 12, ZizJuj_1.1
AM00046	R：TCCTTTGGCTTGTAGTT	631	50	192~629	90~191	Ziziphus jujuba cultivar Dongzao chromosome 12, ZizJuj_1.1
AM00059	F：CATTCGGCTTCACTATCT	311	53	1~114	115~214	Herrania umbratica cultivar Fairchild unplaced genomic scaffold, ASM216827v2 scaffold_50.0
AM00059	R：CGACTTCTCCACCTTTA	311	53	215~311	115~214
AM00075	F：AGTCATCCAGCACTCTAC	268	59	136~258	1~135	Malus x domestica cultivar Golden Delicious chromosome 12, MalDomGD1.0
AM00075	R：CTCACTTACACCTCCCTA	268	59	136~258	259~268
AM00096	F：TGGGAACGAAGAAACAT	320	56	1~291	292~320	Citrus sinensis serine/threonine-protein kinase KIPK-like
AM00096	R：ACACTACAGGCTACATACAAT	320	56	1~291	292~320	Citrus sinensis serine/threonine-protein kinase KIPK-like
AM00107	F：GTCCTCGGTAGGATGTTTGG	159	56	1~155		Citrus sinensis cultivar Valencia chromosome 4, Csi_Valencia_1.0
AM00107	R：ATCGAGAGCAAGAGCCGATA	159	56	1~155
AM00126	F：TTCGGAGAAAGACAGGA	342	53	1~342		Citrus sinensis cultivar Valencia chromosome 9, Csi_Valencia_1.0
AM00126	R：GCTTACTAACAGGCACAGG	342	53	1~342
AM00134	F：GCAGCAGCAAACAAAAAGAA	326	53	1~291	292~326	Bactrocera dorsalis strain Punador unplaced genomic scaffold
AM00134	R：GCCAATGATTTAGAGCAAGGA	326	53	1~291	292~326
AM00150	F：TCAGAAGTCATGCCCATTCA	259	56	1~158	159~259	Gossypium arboreum cultivar Shixiya1 chromosome 11, Gossypium_arboreum_v1.0
AM00150	R：TCAAAATCCTCAACCCCAAG	259	56	1~158	159~259
AM00410	F：ATCAAGCGAGGGAACGA	375	62	1~356	357~375	Theobroma cacao cultivar B97-61/B2 chromosome 7, Criollo_cocoa_genome_v2
AM00410	R：GAGCCAACCTGAGCACC	375	62	1~356	357~375
AM00478	F：CAGTTTCACGAATGCTCCTC	385	65	267~385	1~266	Vitis vinifera cultivar PN40024 chromosome 18, 12X
AM00478	R：TGCCTCCAGTAGAATCCAAG	385	65	267~385	1~266	Vitis vinifera cultivar PN40024 chromosome 18, 12X
AM00497	F：ATCCAACCCACATCACC	288	56	1~288		Durio zibethinus cultivar Musang King isolate D1 unplaced genomic scaffold, Duzib1.0 scaffold_27
AM00497	R：GGAACAACGAGCATTAGAG	288	56	1~288
AM00498	F：CCAGGCAGGAGTCAAGT	205	53	1~205		Populus euphratica unplaced genomic scaffold, PopEup_1.0 scaffold50.1
AM00498	R：AAATGGACGAGCAAATC	205	53	1~205
AM00500	F：CCTTATCTTTCTTCTTTCCCTT	143	59	1~143		Citrus sinensis cultivar Valencia chromosome 5, Csi_Valencia_1.0
AM00500	R：TATGCGTGCCGAACTGG	143	59	1~143
AM00525	F：CGAGCAAGAATGTCAAA	272	53	1~181		Herrania umbratica cultivar Fairchild unplaced genomic scaffold, ASM216827v2 scaffold_4.1
AM00525	R：TCAAGGGCGATAATAAG	272	53	182~272
AM00527	F：GCACCATCGTGTCTTTC	310	59	145~310	1~144	Durio zibethinus cultivar Musang King isolate D1 unplaced genomic scaffold
AM00527	R：GCAGTGGGAGTTCTTGTAT	310	59	145~310	1~144
AM00549	F：CCACCATCGGAGAAACA	397	56	1~397		Citrus sinensis cultivar Valencia chromosome 7, Csi_Valencia_1.0
AM00549	R：AGCCCTTAGAGCCAAAA	397	56	1~397
AM00566	F：AAGGGTGGATAGTCTGC	643	59	1~643		Citrus sinensis cultivar Valencia chromosome 5, Csi_Valencia_1.0
AM00566	R：AAGTGGAATGAGCGTAG	643	59	1~643
AM00609	F：AGACAGGCACTCCAACAC	593	59	1~593		Citrus sinensis cultivar Valencia chromosome 9, Csi_Valencia_1.0
AM00609	R：AAGATTCTATCGGCACATT	593	59	1~593
AM00612	F：ATCATACAATCTACAGCCACAA	297	56	1~293		Citrus sinensis cultivar Valencia chromosome 2, Csi_Valencia_1.0
AM00612	R：TCCAAGGGACCAAGCAAT	297	56	1~293
AM00644	F：CATCAACCCAAGAATCCA	229	59	1~229		Xanthoceras sorbifolium microsatellite BI-H177 sequence
AM00644	R：GTCTGCCAATCAAGCCAC	229	59	1~229		Xanthoceras sorbifolium microsatellite BI-H177 sequence
AM00645	F：GGCTATGGTAGATGGGTG	427	59		1~14, 125~203, 324~427	Hevea brasiliensis cultivar reyan7-33-97 unplaced genomic scaffold,
AM00645	R：ATAAATCGCAAGGAGGGA	427	59		1~14, 125~203, 324~427	ASM165405v1 scaffold0645
AM00646	F：ATCAGAAGACCCTTACACTC	652	59	1~652		Durio zibethinus cultivar Musang King isolate D1 unplaced genomic scaffold, Duzib1.0 scaffold_6
AM00646	R：GTTTATCAGCAATCCCTC	652	59	1~652
AM00661	F：CTCATCCAACGGGTCAA	416	53	1~416		Citrus sinensis cultivar Valencia unplaced genomic scaffold, Csi_Valencia_1.0 scaffold_0096
AM00661	R：GTCGTGCTCTACTTACAAACA	416	53	1~416
AM00687	F：GAGCCAGCACTCCTAAC	399	53	1~399		Theobroma cacao cultivar B97-61/B2 chromosome 3, Criollo_cocoa_genome_v2
AM00687	R：CTCAAGAAGTATTTCACCC	399	53	1~399
AM00699	F：GAGGTTGGTGCGGTCTG	406	59	1~406		Citrus sinensis cultivar Valencia chromosome 8, Csi_Valencia_1.0
AM00699	R：TCGCTTCCCGTTGCTAT	406	59	1~406

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B转录组数据品质情况

样品	原始序列个数	有效序列个数	有效数据量(G)	碱基错误率/%	Q₂₀/%	Q₃₀/%	GC/%
北师大	54974054	51152984	7.67	0.03	94.54	87.71	43.34
大寺沟	47483932	44188476	6.63	0.03	94.65	87.94	44.26
原始序列个数：统计未过滤的原始序列数据，以4行为1个单位，计算每个文件的测序序列的个数．有效序列个数：相同计算方法统计过滤后的测序数据．后续的生物信息分析都是基于有效序列．有效数据量：测序序列的个数乘以测序序列的长度，并转化为以G为单位．Q₂₀、Q₃₀：P>20、30的碱基占总体碱基的百分比．GC含量：碱基G和C的数量总和占总碱基数量的百分比．

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表 226个色木枫核低拷贝基因位点的遗传多样性和交叉扩增情况

位点	样本量	变异位点	单变异位点	简约信息位点	单倍型（H）	单倍型多样性（H_d）	核苷酸多样性（π×10⁻³）	Dipteronia sinensis	Acer ginnala	Acer davidii	Acer palmatum
AM00033	182	17	5	12	19	0.67	3.09	−	+	−	−
AM00046	182	50	13	37	56	0.90	4.31	+	+	−	−
AM00059	181	16	4	12	17	0.50	2.11	−	−	−	−
AM00075	182	35	9	26	50	0.87	7.81	−	+	−	−
AM00096	182	27	11	16	30	0.60	2.86	−	−	+	+
AM00107	182	33	13	20	57	0.90	14.47	+	+	+	+
AM00126	182	37	11	26	46	0.88	8.87	+	−	−	−
AM00134	173	74	19	55	61	0.93	18.03	−	−	−	−
AM00150	182	20	8	12	23	0.83	6.76	+	+	+	+
AM00410	177	37	8	29	57	0.92	11.90	+	+	+	+
AM00478	182	34	4	30	27	0.79	10.64	−	−	−	−
AM00497	182	17	3	14	19	0.63	3.48	+	+	+	+
AM00498	182	23	8	15	29	0.69	5.48	+	+	+	+
AM00500	182	6	1	5	7	0.62	5.23	−	+	+	+
AM00525	172	36	11	25	37	0.83	9.36	−	+	−	+
AM00527	182	28	7	21	32	0.45	1.90	−	+	−	+
AM00549	182	43	13	30	56	0.94	9.05	+	+	+	+
AM00566	173	26	8	18	20	0.74	3.03	−	−	−	−
AM00609	182	65	20	45	74	0.94	5.03	−	−	+	+
AM00612	182	45	18	27	51	0.89	13.28	+	−	+	−
AM00644	182	33	13	20	42	0.91	14.53	+	+	+	+
AM00645	178	65	27	38	57	0.78	6.76	−	−	−	−
AM00646	182	42	13	29	52	0.88	3.67	+	−	−	−
AM00661	182	69	19	50	63	0.94	12.19	+	+	+	+
AM00687	182	43	15	28	67	0.97	7.64	+	+	+	+
AM00699	172	43	13	30	49	0.83	5.20	−	−	−	−
“+”表示该行引物可在该列物种中成功扩增；“−”表示该行引物无法在该列物种中成功扩增．

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